ABORDĂRI TERAPEUTICE ÎN DEZVOLTARE PENTRU DISTROFIA MUSCULARĂ

Rezumat:

Distrofia musculară Duchenne este o boală musculară progresivă severă provocată de mutaţii ale genei DMD care codifi că distrofina . Distrofina conferă stabilitate fibrelor musculare în timpul exerciţiului şi absenţa distrofinei duce la o pierdere progresivă a ţesutului muscular şi a funcţiei musculare. În prezent există mai multe abordări terapeutice aflate în diferite stadii de dezvoltare. Vom trece în revistă abordările terapeutice genetice, creşterea răspunsului celular la utrofină şi abordările care urmăresc îmbunătăţirea calităţii muşchilor, cu accent pe abordările care, în prezent, sunt în faza de studiu clinic.

Distrofiile musculare Duchenne şi Becker (DMD şi respectiv DMB) sunt provocate de mutaţii ale genei DMD care codifică distrofina. DMD este cea mai frecventă şi mai severă boală musculară cu transmitere
ereditară, cu o incidenţă de ~1 la 4000 de nou născuţi de gen masculin. În general, băieţii prezintă slăbiciune musculară în primii ani de viaţă, căderi frecvente, dificultate în urcarea scărilor şi semnul Gowers [1]. Cei mai mulţi băieţi devin dependenţi de scaunul cu rotile până la vârsta de 12 ani şi necesită ventilaţie asistată înainte de vârsta de 20 de ani. Decesul intervine adesea în a treia sau a patra decadă datorită insuficienţei respiratorii sau cardiace. DMB este o boală musculară mai puţin severă şi mai puţin frecventă (incidenţă ~1 la 20000) decât DMD, cu nuanţe de severitate mai variate. Diagnosticul poate fi pus încă de la vârsta de 4 ani dar şi la 60 de ani sau mai târziu. În general, pacienţii cu DMB îşi păstrează mersul timp de 10 ani după diagnostic. Speranţa de viaţă este de la uşor redusă la normală [1]. Discrepanţa dintre fenotipuri constă în funcţia proteinei distrofină [2].

Distrofina conferă fibrelor musculare stabilitate în timpul contracturii prin legarea actinei citoscheletice la matricea extracelulară (Figura 1A). La pacienţii cu DMD mutaţiile întrerup cadrul de citire deschis şi translaţia distrofinei este trunchiată permanent, ceea ce face ca distrofina să devină permanent non-funcţională (Figura 1B). Prin contrast, la pacienţii cu DMB, se menţine cadrul de citire deschis şi translaţia distrofinei continuă până la capăt. Distrofinele care rezultă sunt şterse în interior dar sunt încă parţial funcţionale. (Figura 1C).

Patologia DMD nu a fost încă elucidată complet, dar s-a propus idea că pierderea de fibre musculare este rezultatul diferitelor căi de interacţiune în care dis-trofina joacă un rol important [3-6]. În primul rând, datorită absenţei distrofinei funcţionale, fibrele musculare sunt deteriorate continuu în timpul contracţiilor. Această deteriorare şi/sau activare mărită a canalelor calciului prin întindere are drept rezultat nivele mărite ale ionului de calciu, Ca2+ în fibre [5]. Această situaţie activează în continuare calpainele (proteaze) şi duce, de asemenea, la deteriorarea mitocondriilor care produc stresul oxidativ în fibrele musculare. Ambele procese cresc gradul de deteriorare a fibrei musculare. Datorită naturii persistente a deteriorării, muşchii sunt inflamaţi cronic. Celulele inflamatorii produc citokine şi alte toxine care deteriorează şi mai mult celulele musculare şi, de asemenea, împiedică regenerarea muşchilor şi măresc formarea fibrozei [6]. În consecinţă, fibrele musculare se pierd continuu, procesul de regenerare musculară este deteriorat şi, în cele din urmă, muşchiul este înlocuit cu ţesut fibros şi adipos iar funcţia musculară se pierde progresiv. Datorită deteriorării fibrei musculare, enzima specifică muşchilor, creatin kinaza, pătrunde în fluxul sanguin şi nivelul ei este mult mai ridicat la pacienţii mai tineri.

FIGURA 1

A) La adulţii neafectaţi, cadrul de citire al distrofinei mARN este intact şi o proteină distrofină completă, funcţională poate fi reprodusă. Proteina furnizează o legătură între actina citoscheletică şi matricea extracelulară. Prin aceasta ea conferă stabilitate fibrelor musculare în timpul contracţiilor şi previne deteriorarea muşchilor.
B) În DMD, mutaţiile perturbă cadrul deschis de citire a distrofinei mARN. Acest lucru face ca translaţia să se oprească prematur. Proteina care rezultă nu este funcţională, deoarece legătura dintre actină şi matricea extracelulară este pierdută şi fibrele musculare sunt expuse deteriorării.
C) În DBM, o parte a genei DMD este ştearsă, dar cadrul deschis de citire al distrofinei mARN rămâne intact. De aceea, o proteină puţin mai scurtă, ştearsă în interior, se poate forma. Această proteină este încă funcţională în mare parte şi poate furniza o legătură funcţională între actina citoscheletică şi matricea extracelulară.

Când pacienţii înaintează în vârstă şi ţesutul muscular este pierdut, nivelul descreşte datorită cantităţii scăzute de ţesut muscular [7]. Cu toate că gena şi proteina au fost identificate acum mai mult de două decade, în mod curent nu există un tratament curativ pentru DMD. Pacienţii sunt trataţi simptomatic. Datorită îngrijirilor îmbunătăţite [8,9] speranţa de viaţă a crescut de la sub două decade la peste trei decade în lumea Occidentală.

În prezent pacienţii sunt trataţi cu corticosteroizi, pentru care nu se cunoaşte mecanismul exact de acţiune, dar se crede că ei acţionează prin inhibarea inflamării cronice. Deşi acest lucru nu este fără efecte secundare, la cei mai mulţi dintre pacienţi, tratamentul cronic cu corticosteroizi duce la o întârziere în evoluţia bolii, fapt care se reflectă în ambulaţie prelungită, funcţie respiratorie mărită, forţă îmbunătăţită în membrul superior, scolioză redusă şi/ sau funcţie cardiacă îmbunătăţită [10].

În această trecere în revistă vom furniza un sumar al noilor abordări terapeutice care fie ţintesc deficitul de distrofină direct, fie urmăresc să îmbunătăţească calitatea muşchilor, concentrându-ne asupra acelor terapii care sunt pe punctul de a fi studiate clinic sau sunt deja testate în studiile clinice.

TERAPIILE CU MEDICAMENTE CARE ÎMBUNĂTĂŢESC CALITATEA ŞI MASA MUŞCHILOR

Întrucât simptomele din DMD şi DMB sunt provocate de o pierdere a fibrelor musculare, progresia bolii ar putea fi întârziată prin îmbunătăţirea calităţii sau masei muşchilor. Idebenone (Catena®) este un compus care reduce stresul oxidativ, acţionând ca un „gunoier” al radicalilor liberi şi îmbunătăţeşte funcţia mitocondrială, mărind producţia de Adenozin Triphosfat (ATP) şi protejând mitocondriile de per-oxidarea lipidelor [11]. În modelul şoarecelui mdx, tratamentul cu idebenone a avut ca rezultat reducerea inflamaţiei şi nivele scăzute ale fibrozei în inimă, prin aceasta normalizând funcţia inimii şi îmbunătăţind alergarea voluntară [12]. Într-un mic studiu clinic aflat în faza I/II la pacienţii cu DMD nu s-a observat nici o diferenţă semnificativă în funcţionarea inimii [13].

Totuşi, acest studiu nu a fost ideal datorită numărului mic de pacienţi şi faptului că grupul tratat a fost semnificativ mai în vârstă decât grupul tratat placebo. Cu toate acestea, capacitatea vitală forţată a pacienţilor trataţi a fost mai bună decât a celor cu tratament placebo, sugerând un efect protector asupra funcţiei respiratorii. Idebenone este testat în prezent pe un grup mai mare de pacienţi cu DMD în două stadii; primul, pe pacienţi care nu au fost trataţi niciodată cu corticosteroizi şi apoi, în combinaţie cu corticosteroizi (http:// clinicaltrials.gov/ ct2/show/ NCT01027884). Se anticipează obţinerea de rezultate la începutul anului 2014.

În mod similar, extractul de ceai verde fără cofeină a redus fibroza şi a îmbunătăţit funcţia musculară la şoarecii mdx [14]. Acest compus este testat în prezent într-un mic studiu clinic în Germania pe pacienţi cu DMD (http://clinicaltrials.gov/ct2/show/ NCT01183767).

Există o multitudine de alţi compuşi care au îmbunătăţit calitatea muşchilor la şoarecii mdx, unii dintre ei fiind de asemenea testaţi în prezent în cadrul unor studii clinice pe pacienţi (vezi Tabelul 1). Totuşi, trebuie să conştientizăm faptul că absenţa distrofi-nei este mai puţin dezastruoasă la şoarecii mdx decât la om. Datorită unei regenerări foarte eficiente şi a fenomenului „up-regulation” cu efect asupra utro-finei, supravieţuirea la şoarecii mdx este aproape normală, funcţia muşchilor este doar uşor afectată în comparaţie cu şoarecii sălbatici şi calitatea muşchilor este mult mai bună decât la om. De aceea, compuşii care au un efect asupra calităţii muşchilor la şoareci nu au neapărat un efect şi asupra oamenilor.

Se fac, de asemenea, încercări de a îmbunătăţi masa musculară, pentru a compensa pierderea de ţesut muscular. Există factori de creştere care măresc masa musculară şi factori care inhibă formarea masei musculare. Din cea de-a doua categorie, myostatin este cel mai cunoscut, întrucât mutaţiile care conduc la pierderea completă de myostatin sunt viabile şi au fost descrise pe numeroase animale (de exemplu vite Belgium Blue, oi Texel şi câini) şi pe un băiat [15]. În fiecare caz, lipsa de myostatin are ca rezultat o creştere vastă a masei musculare. Astfel, prin inhibarea myo-statinului, s-ar putea, probabil, compensa pierderea de ţesut muscular observată la pacienţii cu DMD precum şi la alte boli unde pierderea de ţesut muscular este principalul simptom (i.e. cele mai multe tulburări neuromusculare). Tratamentul cu anticorpul anti-myostatin la pacienţii adulţi cu boli musculare (inclusiv pacienţii cu DMB) nu a condus la o creştere semnificativă a masei musculare la primul studiu clinic [16]. Totuşi, ar trebui notat faptul că pacienţii au fost trataţi doar o lună. Între timp, a fost creată o nouă proteină de fuziune care uneşte un receptor FC al anticorpului uman şi domeniul de legătură li-gand al receptorului activinei de tip IIB (ACE-031) [17]. Acest receptor poate lega myostatinul, dar şi pe membrul familiei sale TGF-P, care este implicat în formarea fibrozei în multe boli, inclusiv DMD. Astfel, ACE-031 poat acţiona prin mecanisme separate simultan, atât prin creşterea masei musculare cât şi prin inhibarea fibrozei. La şoareci, tratamentul a avut ca rezultat o masă musculară crescută în detrimentul ţesutului adipos. Tratamentul a fost bine tolerat atât pentru o doză cât şi pentru doze multiple (www.ac-celeronpharma.com). Recent, un studiu clinic privitor la siguranţa creşterii dozelor la pacienţii cu DMD a fost suspendat datorită sângerărilor inexplicabile ale nasului şi gingiilor şi a vaselor mici de sânge dilatate observate la unii dintre pacienţii trataţi (www. acceleronpharma.com). Mecanismul acestor efecte secundare neaşteptate este în prezent în curs de investigare.

TERAPIA GENICĂ

Întrucât DMD este o boală recesivă mono-alelică, terapia genică este o abordare terapeutică logică: adăugarea a unei gene funcţionale a DMD ar permite producerea proteinei distrofin la pacienţi. Virusurile sunt foarte eficiente în furnizarea informaţiei genomice ţesuturilor gazdă şi vectorilor virali, acolo unde genele virale au fost înlocuite de o genă la alegere, ele sunt utilizate în general pentru a distribui gene terapeutice. Cu toate acestea, există două dificultăţi majore pentru dezvoltarea terapiei genice pentru DMD. Prima constă în abundenţa şi accesibilitatea ţesutului muscular. Ţesutul muscular alcătuieşte 30-40% din corpul uman şi în DMD este afectată cea mai mare parte din muşchii scheletici şi inimă. Astfel, va fi dificil să se ţintească fiecare fibră musculară sau chiar majoritatea acestora. Acest lucru este impiedicat în continuare de faptul că fibrele musculare sunt înconjurate de straturi de ţesuturi conjunctive, care filtrează cea mai mare parte a particulelor virale mai mari.

De fapt, există doar un singur vector viral care poate infecta eficient muşchiul postmitotic şi fibrele inimii, vectorul viral adeno-asociat (AAV) [18]. AAV este un virus mic şi în această calitate capacitatea lui este limitată la ~4.9 kb. Din nefericire, gena DMD este cea mai mare genă identificată în genomul uman, cu 2.4 Mb ea reprezintă aproape 0,1% din întregul genom. Chiar şi secvenţa de codificare este prea mare (11 kb) pentru a fi cuprinsă de vectorii AAV. Totuşi, există pacienţi DMB cărora le lipsesc părţi mari din domeniul central, ceea ce înseamnă că atât timp cât sunt prezente domeniile de legătură atât ale actinei cât şi ale matricei extracelulare şi unele dintre părţile care se întrepătrund, distrofina va avea o funcţionalitate parţială [19]. Astfel, pe cale sintetică, au fost alcătuite microdistrofine care conţin doar cele mai importante domenii [18]. Au fost generate numeroase astfel de microdistrofine, şi când s-au exprimat ca transgene într-un mediu negativ de distrofină, ele au îmbunătăţit funcţia şi calitatea muşchilor [18]. Una dintre cele mai utilizate microdistrofine conţine domeniul de legătură al actinei N-terminal, domeniul bogat în cisteină (care conectează la matricea extracelulară), 4 dintre cele 24 de domenii de repetare asemănătoare spectrinelor şi 3 din cele 4 domenii de ancorare bogate în prolină care sunt localizate între secvenţa N-terminală şi domeniul bogat în cisteină. Gena care codifică aceste microdistrofine este destul de mică pentru a se fixa în interiorul unui vector AAV şi tratamentul sistemic şi local al şoarecilor mdx cu un vector AAV care conţinea această genă a avut ca rezultat o tranducţie bună şi o îmbunătăţire a funcţiei musculare şi a calităţii muşchilor. [20]. S-a demonstrat că tratamentul cu vectori AAV care conţin microdistrofină şi factori de permeabilizare vasculară provoacă o expresie a distrofinei în muşchii scheletici şi în inimă, chiar dacă este vorba de niveluri mai scăzute decât cele observate la muşchii scheletici. [21]. Există multe stereotipuri AAV, dintre care unele au un tropism extrem pentru muşchi (e.g. AAV5, AAV8 and AAV9) şi inimă (e.g. AAV8) şi astfel ele sunt ideale în terapia genică pentru muşchi.

A doua dificultate este imuniatea potenţială faţă de AVV şi/sau microdistrodistrofine, deoarece, din păcate, în ciuda primelor rapoarte că vectorul AAV nu este imunogenic, s-a dovedit că aceste AAV provocau la şoareci un răspuns de tip anticorp şi o reacţie imună de mai mare amploare (atât anticorpi cât şi celule T) la animale mai mari şi la om [22]. A fost efecuat un studiu clinic unde microdistrofina a fost furnizată de către AAV prin injecţie intramusculară la 6 pacienţi, fără represie imună [23]. S-a descoperit un răspuns imun faţă de capsida virală în biopsia musculară a fiecăruia din cei 6 pacienţi injectaţi, în timp ce doar la doi pacienţi s-au descoperit puţine fibre musculare care exprimau microdistrofina. Cu totul neaşteptat, un răspuns imun a fost descoperit la 4 pacienţi, la microdistrofina nou exprimată [23]. S-a presupus mereu că restaurarea distrofinei nu va avea ca rezultat un răspuns imun la pacienţii cu DMD, întrucât mulţi dintre pacienţi produc o mică cantitate de distrofină. Aceasta poate fi sub forma fibrelor revertante (i.e. fibre distrofin-pozitive datorită fie unei ignorări spontane a exonului sau unei mutaţii secundare de refacere a cadrului de citire, care sunt prezente la niveluri scăzute la cei mai mulţi dintre pacienţi) şi/sau a cel puţin unor izoforme ale distrofinei care sunt încă exprimate la cei mai mulţi dintre pacienţi, întrucât promotorul omniprezentei izoforme Dp71 este localizat în intronul 62, care se găseşte la cei mai mulţi dintre pacienţi.

Este interesant că, la doi pacienţi, celulele T specifice distrofinei erau deja prezente înainte de injectarea cu AAV care conţinea microdistrofină [23]. Studii recente au arătat că mai mulţi pacienţi conţin celule T autore-active care recunosc distrofina din circulaţia lor (Jerry Mendell, comunicare personală). Nu este încă foarte clar dacă această situaţie va avea consecinţe negative asupra terapiilor de restaurare a distrofinei. Celulele T au fost descoperite doar în circulaţie nu şi în ţesutul muscular al pacienţilor; mai mult, aceşti pacienţi au fibre rever-tante care conţin epitopi de distrofină recunoscuţi de către celulele T, ceea ce sugerează că aceste celule T nu depăşesc limitele pentru a ţinti fibrele musculare care exprimă distrofina [24].

Din păcate, tratamentul cu AAV al întregului corp nu este fezabil în prezent la om şi răspunsul imun obţinut de către AAV va împiedica injecţiile repetate cu AAV. Cercetările curente optimizează tratamentul grupelor de muşchi sau a membrelor şi utilizează suprimarea temporară a imunităţii pentru a permite tratamentele repetate.

TERAPIA CELULARĂ

Terapia celulară este de fapt o formă de terapie genică întrucât celule de la un donator sănătos vor conţine gena funcţională DMD. Beneficiul suplimentar este că aceste celule vor contribui de asemenea la regenerarea muşchilor deterioraţi ai pacienţilor. În teorie, terapia celulară pare astfel foarte atrăgătoare. Totuşi, din nou, abundenţa şi accesibilitatea ţesutului muscular împiedică această abordare. Mai mult, ţesutul muscular este în primul rând post-mitotic. La deteriorarea muşchiului, celulele satelit sunt activate şi proliferează ca să repare defectul [25]. Aceste celule satelit pot fi izolate de la donatori sănătoşi şi multiplicate şi celulele rezultate (numite mioblaste) pot fi transplantate la pacienţi. Din păcate, primele studii clinice care au folosit acest procedeu au arătat că majoritatea mioblastelor au murit repede şi nici una din ele nu a fost în stare să părăsească fluxul sanguin pentru a migra spre ţesutul muscular [25]. Chiar şi la injectarea directă în muşchi, migrarea mioblastelor a fost slabă. Pentru a depăşi acest inconvenient, s-au folosit injecţii multiple şi s-a obţinut restaurarea dis-trofinei prin injecţii multiple (25 -250) pe centimetru cub [26,27].

Dacă acest procedeu poate fi fezabil în cazul unor muşchi mici superficiali, el nu se poate aplica în cazul când sunt afectaţi muşchi mai mari şi / sau mai greu de abordat cum ar fi diafragma sau când tratamentul vizează întregul corp.

A devenit clar că există alte celule stem care sunt capabile să migreze din fluxul sanguin în ţesutul muscular şi să participe la regenerarea fibrei musculare. Acestea includ celule din sistemul imunitar, din pereţii vaselor de sânge (mesangioblaste), celule stem grase (pericite) şi celule osoase [25]. Pentru cele mai multe dintre aceste celule eficienţa este foatre scăzută şi adesea, fibrele distrofin pozitive la modelele animalelor tratate sunt sub 5%.

Mesangioblastele sunt tipul cel mai promiţător de celule de până acum. La modelul distrofiei musculare manifestate la câini rasa Labrador (GRMD), transplantul mesangioblastelor prin injecţie intra-arterială a avut ca rezultat până la 10% fibre distrofin-pozitive precum şi o îmbunătăţire funcţională a acestor câini [28]. In luna martie 2011 a fost iniţiat în Italia un studiu clinic în care pacienţi cu DMD vor suferi mai multe transplanturi consecutive de mesangioblaste de la membrii sănătoşi ai familiei care au trecut testul de compatibilitate HLA, (Giulio Cossu, comunicare personală).

CREŞTEREA RĂSPUNSULUI CELULAR LA UTROFINĂ

În loc să încerce să aducă distrofina înapoi în muşchi, o strategie alternativă este să mărească expresia utrofinei, un omolog autosomal al distrofinei, care poate să compenseze funcţional (într-o anumită măsură) lipsa distrofinei. Ca şi distrofina, utrofina formează o legătură între scheletul celular şi matricea extracelulară. Din punct de vedere structural, utrofina este foarte similară distrofinei: domeniul terminal-N, domeniul bogat în cisteină şi domeniul terminal-C prezintă o asemănare de ~80%, iar domeniul de repetare a proteinelor asemănătoare spectrinei, este asemănător în proporţie de ~35%.

Utrofina este prezentă pretutindeni în muşchi în stadiile fetale timpurii, dar nivelele descresc în timpul dezvoltării iar în muşchii adultului se găseşte doar în joncţiunea neuromusculară, pentru a-i menţine integritatea structurală. În procesul de dezvoltare şi regenerare a fibrelor ea este prezentă de-a lungul întregii sarcoleme, unde este apoi înlocuită de distrofină. În absenţa distrofinei, utrofina poate fi găsită de-a lungul membranei întregii fibre musculare unde recrutează cele mai multe proteine care sunt asociate în mod normal cu distrofina [29-31]. Atât la pacienţii cu DMD cât şi la modelul şoarecelui mdx, se măreşte răspunsul celular al utrofinei [32], chiar dacă în mai mare măsură la şoareci, ceea ce, în parte, susţine faptul că şoarecii sunt mai puţin afectaţi decât omul de absenţa distrofinei. Într-adevăr, un şoarece fără distrofină şi fără utrofină este afectat sever şi moare la vârsta de 2-3 luni [33].

La modelul şoarecelui mdx s-a arătat că supraex-presia transgenică a microutrofinei ameliorează feno-tipul distrofic [34]. Utrofina completă este chiar mai eficientă şi ar putea preveni patologia [35].
Acest fapt a iniţiat o multitudine de teste pentru probarea medicamentelor care pot să mărească expresia utrofinei. Pentru evaluarea potenţialului a nenumărate medicamente, a fost folosit un model celular care exprimă stabil promotorul utropinei legat de luciferază. Dintre aceste medicamente, SMTC1100, a fost unul dintre cele mai eficiente [36]. Efectele sale au fost validate pe modelul şoarecelui mdx, unde tratamentul oral cu acest compus a mărit expresia utro-finei până la dublare, a avut ca rezultat îmbunătăţirea histologiei şi funcţiei muşchilor [36]. Din păcate, faza I a studiului clinic la voluntarii sănătoşi a relevat faptul că nivelele din plasmă ale medicamentului necesare pentru a declanşa un efect nu pot fi obţinute la om [36].

Cercetările actuale sunt concentrate pe reformula-rea acestui compus şi pe verificarea altor compuşi care ar putea mări expresia utrofinei.

Biglycan este o proteină endogenă care este prezentă în timpul dezvoltării exteriorului fibrelor muşchilor scheletici şi al muşchiului cardiac. Ea joaccă un rol important în reglarea căilor de semnalare şi a proteinelor structurale, printre care proteinele care fac parte din glicoproteina asociată distrofinei [37].Injecţia cu Biglycan (locală şi sistemică) la şoarecii mdx a avut ca rezultat creşterea răspunsului celular al atrofinei şi îmbunătăţirea funcţiei musculare şi a rezistenţei la deteriorarea provocată de exerciţii [38]. Studiile clinice sunt planificate să înceapă în 2012 sau 2013.

TERAPII SPECIFICE MUTAŢIEI – CITIREA CODONILOR STOP

S-a demonstrat că unele dintre antibioticele ami-noglicozide au potenţialul de a forţa mecanismul de translaţie să ignore codonii stop şi să introducă în loc un aminoacid. Acest fapt ar avea un potenţial terapeutic pentru un procent estimat de 14% dintre pacienţii purtători de mutaţii nonsens undeva în gena DMD, în timp ce restul transcripţiei rămâne neafectat [39]. Studiile in vitro pe celule obţinute de la pacienţi cu DMD /DMB au evidenţiat eficienţe variable ale citirii (de la 1 la 10%) şi au arătat că acest fenomen depinde de tipul de mutaţie a codonului stop (UAA, UAG şi UGA) şi de nucleotidele care flanchează codonul stop. [40]. Primele studii cu gentamicină în modelul şoarecelui mdx (care are o mutaţie nonsens în exonul 23 al genei Dmd la şoareci) au avut ca rezultat nivele ale distrofinei de până la 20% [41]. Studiile clinice care au decurs de aici efectuate asupra pacienţilor au avut rezultate slabe. S-a dovedit că acestea s-au datorat diferiţilor izomeri ai gentamicinei. Doar un singur izomer a avut o activitate ridicată de citire, şi loturile de gentamicină conţin un amestec de izomeri diferiţi, a căror proporţie diferă între diferitele loturi [42]. Un studiu clinic recent, în care s-a utilizat izo-merul potrivit, a avut ca rezultat o scădere a nivelului de creatinkinază din plasma pacienţilor cu mutaţii ale codonului stop, în timp ce pacienţii care au suferit modificarea cadrului de citire a mesajului genetic (mutaţii de tip „frameshift”) au rămas fără efecte la o lună de la tratamentul cu gentamicină [43].

Un studiu follow up în care pacienţii cu mutaţii ale codonului stop au fost trataţi timp de şase luni a dus la o creştere clară a nivelurilor de distrofină (până la 15%) în 3 din 16 pacienţi [43]. Din păcate, tratamentul cronic cu gentamicină este toxic, astfel încât, datorită riscului de oto- şi nefrotoxicitate ireversibilă, tratamentul pe termen lung cu acest antibiotic nu este posibil.

Un sistem de verificare într-un sistem de celule cu o enzimă luciferază cu o mutaţie stop a identificat un compus nou cu potenţial de citire. Acest compus, PTC 124 (ataluren), are un profil de siguranţă mult mai bun decât gentamicina. El este mai selectiv pentru codonii stop prematuri şi s-a raportat că nu influenţează citirea codonilor stop normali [44]. Mai mult, spre deosebire de gentamicină, care trebuie administrată intravenos, acest compus poate fi administrat oral. Studii asupra modelului şoarecelui mdx au prezentat niveluri ale distrofinei de până la 25% împreună cu forţă musculară crescută şi niveluri scăzute ale creatinkinazei în sânge [45].

Un studiu pe pacienţi voluntari a confirmat că atalurenul a fost bine tolerat, iar într-un studiu unde pacienţii au fost trataţi timp de 4 săptămâni cu diferite doze de ataluren, s-a confirmat o creştere modestă a nivelului de distrofină [46]. Într- studiu în faza II/ III controlat prin placebo, pacienţii au fost trataţi cu două doze sau placebo timp de 48 de ore apoi toţi au fost trataţi cu o doză mare, într-un studiu extensie tip „open-label” [46]. Din păcate, rezultatul primar (îmbunătăţire de 30 de metri la testul de mers timp de 6 minute) nu a fost atins şi extensia studiului a fost întreruptă. Ceea ce este interesant aici este că nu s-a putut găsi nici o diferenţă între grupul care a primit doza mare şi grupurile palcebo, în timp ce grupul care a primit doza mai mică părea că se simte mai bine, deşi nu în mod semnificativ. Acest lucru sugerează faptul că medicamentul are o „curbă în formă de clopot”, ceea ce înseamnă că există o concentraţie optimă şi că atât concentraţiile mai scăzute cât şi cele mai înalte au un randament mai scăzut. Nu au fost raportate încă rezultate ale analizei nivelului de distrofină. În prezent se derulează diferite analize ale subgrupelor de pacienţi, precum şi studii pentru identificarea dozei celei mai potrivite. Studiul de extensie „open label” a fost redeschis în SUA, dar nu şi în alte părţi ale lumii.

IGNORAREA („SKIPPING-UL”) EXONULUI

Abordarea care în prezent este cea mai apropiată de aplicarea în clinică este ignorarea exonului prin mediere anitsens (skipping-ul). Aici, scopul este de a reface cadrul de citire a transcriptelor distrofinei prin manipularea procesului de înădire pentru a permite producerea unei distrofine parţial funcţionale, asemănătoare cu cea DMB. Acest procedeu poate fi realizat folosind oligonucleotide antisens, care sunt părţi modificate de ADN sau ARN care hibridizează spre un exon ţintă în timpul îmbinării pre – mARN, prin aceasta ascunzând-o de mecanismul de înădire, rezultatul fiind ignorarea exonului ţintă [47]. Pentru cei mai mulţi pacienţi cu DMD, cadrul de citire poate fi refăcut prin ignorarea unuia sau a doi exoni [39]. Acest procedeu nu se potriveşte tuturor pacienţilor, întrucât domeniile de ancorare la citoschelet şi matricea extracelulară sunt esenţiale pentru funcţionalitatea proteinei. Din fericire,majoritatea pacienţilor cu DMD au deleţiile concentrate în regiunea dintre exonul 45 şi exonul 55 în domeniul central redundant al proteinei. De asemenea, această concentrare înseamnă că, în timp ce ignorarea exonului este o abordare medicală personalizată, ignorarea unora dintre exoni se poate aplica mai multor pacienţi. Cel mai mare grup de pacienţi ar beneficia de ignorarea exonului 51 (13% dintre toţi pacienţii) [39], fapt pentru care acesta este în prezent ţinta pentru dezvoltarea clinică a aceastei abordări.

După experimentele iniţiale care au arătat că ignorarea exonului şi refacerea distrofinei era fezabilă în culturile de celule derivate de la pacient şi a avut ca rezultat şi îmbunătăţirea funcţională în modelul şoarecelui mdx, ignorarea exonului 51 a fost testată în studii clinice pe pacienţi cu DMD [47]. În prezent există două modificări chimice diferite care sunt explorate pe pacienţi: Prosensa Therapeutics şi GlaxoSmithKline (GSK) folosesc modificarea 2′-O-methyl phosphorothioate (2OMePS, PR0051/ GSK2402968), în timp ce AVI-Biopharma foloseşte oligomeri morpholino phosphorodiamidate (PMO, AVI-4658) [24]. Ambele studii au prezentat niveluri comparabile de distrofină după injecţia cu respectivii compuşi, fără efecte secundare semnificative [48-50]. În timp ce aceste studii au fost cruciale şi au demonstrat pentru prima oară o refacere semnificativă a distrofinei la pacienţi, se impune necesitatea unui tratament general al întregului corp. Oligonucleotidele antisens sunt foarte mici şi din această cauză vor fi filtrate de rinichi ceea ce duce la o rată de înjumătăţire în plasmă scurtă. Pentru PMO, aceasta este într-adevăr situaţia, dar oligonucleotidele antisens 2OmePS au o rată de înjumătăţire în plasmă mult îmbunătăţită, întrucât atomul de sulf din fosforotioat permite o afinitate scăzută la ancorarea de proteinele plasmei care acţionează ca purtător şi previne eliminarea din rinichi [51]. Totuşi, întrucât absorbţia oligonucleotidelor antisens de către muşchiul sănătos este foarte scăzută, s-a crezut multă vreme că tratamentul generalizat al ţesutului muscular cu oligonucleotide antisens va fi dificilă. Cu toate acestea, studiile în care şoareci sălbatici şi mdx au fost trataţi cu nucleotide antisens 2OmePS au arătat că absorbţia în muşchiul distrofic este de până la de 10 ori mai mare decât în muşchiul sănătos [52]. Se porneşte de la ipoteza că oligonucleotidele antisens (atât PMO cât şi 2OmePS) pătrund în fibrele musculare prin aceleaşi găuri care permit creatinkinazei să scape. Astfel, în evoluţie, starea care crează boala facilitează în acelaşi timp furnizarea unui compus terapeutic.

După optimizarea tratamentului sistemic la modelele animale, au fost iniţiate experimente sistemice pentru ambele componente. Pentru 2OmePS un experiment cu PRO051 a fost încheiat în 2009 unde grupe de pacienţi au primit 5 injecţii subcutanate săptămânale în doze care au variat de la 0,5 mg/kg la 6 mg/kg. Toţi pacienţii s-au înscris apoi într-un studiu de extensie tip „open label”, unde au primit săptămânal injecţii subcutanate cu cea mai mare doză. Experimentul a avut ca rezultat ignorarea exonului 51 şi refacerea distrofinei în majoritatea fibrelor musculare (60-100%) într-un mod dependent de doză, la nivele de până la 16%, în absenţa unor efecte secundare serioase [53].

Mai important, după 3 luni în studiul de extensie tip „open label”, s-a observat o îmbunătăţire clară la testul de mers timp de 6 minute pentru cei mai mulţi dintre pacienţi [53]. Desigur, aceste rezultate trebuie interpretate cu un mare grad de atenţie întrucât nu există un grup placebo şi un efect placebo este de aşteptat, deoarece toţi pacienţii ştiu că primesc medicamentul. În luna ianuarie 2011, GSK a iniţiat un experiment cu control placebo unde 180 de pacienţi vor fi trataţi fie cu GSK2402968 fie placebo timp de 12 luni pentru a evalua dacă tratamentul pe termen lung cu acest oligonnucleotid antisens este sigur şi duce la o îmbunătăţire funcţională. În paralel, un studiu unde sunt comparate 2 regimuri de doze diferite şi un studiu pentru evaluarea profilului farmacodinamic la pacienţii care nu pot să meargă sunt planificate şi în curs de desfăşurare vizând acelaşi medicament. În final, Prosensa conduce un studiu clinic privind creşterea dozei la PRO044, un 2OmePS care are ca ţintă exonul 44 (aplicat pe 6% dintre pacienţi). (Vezi Tabelul I).

Un studiu sistemic cu AVI-4658 a fost de asemenea finalizat. Aici pacienţii au primit săptămânal infuzii in-travenoase cu 0.5 mg/kg – 20 mg/kg de PMO timp de 12 săptămâni. Din nou s-a observat o creştere a nivelu-
lui de distrofină în funcţie de doză. În special 3 dintre pacienţi au răspuns foarte bine (fiecare în câte un grup: 2 mg/kg, 10 mg/kg şi 20 mg/kg), prezentând distrofină în până la 50% din fibre şi niveluri de până la 21% şi în 2 dintre grupele cu cea mai mare doză (10 şi 20 mg/kg) toţi pacienţii au prezentat în mod clar refacerea dis-trofinei. (Muntoni, comunicare personală). Un studiu unde vor fi testate doze şi mai mari (30 şi 50 mg/kg) timp de 6 luni va fi iniţiat curând.

Deşi absorbţia de ONA (oligonucleotide antisens) este mai bună în muşchiul DMD decât în muşchiul sănătos, se fac cercetări pentru a îmbunătăţi în continuare absorbţia de către ţesuturile vizate (muşchi şi inimă). Pentru oligomerii PMO combinarea lor cu o peptidă care pătrunde în celulă (pPMO), creşte în mod semnificativ eficienţa ignorării exonului (chiar şi în ţesutul cardiac) la modelele de şoareci [54,55] şi ar putea chiar să salveze şoarecele dublutransgenic cu afecţiune foarte severă datorată deficienţei de distrofină/utrofină [56]. Totuşi, compuşii pPMO s-au dovedit a fi toxici la primate [57] şi peptida ar putea să evoce un răspuns imun. Specificitatea mutaţiei din această abordare va impune o provocare majoră deoarece în mod curent fiecare oligonucleotidă antisens este considerată un nou medicament de către autorităţile legale ceea ce înseamnă că fiecare dintre ele va trebui să parcurgă teste preclinice de toxicitate şi va fi necesar să treacă prin fazele studiului clinic [58]. Există speranţe că probabil testări clinice de amploare mai mică vor fi permise pentru viitoarele oligo-nucleotide antisens de către autorităţi odată ce siguranţa şi eficacitatea va fi confirmată pentru 2 (sau mai multe) oligonucleotide antisens din aceiaşi categorie chimică. În oricare dintre cazuri, fazele de dezvoltare tradiţionale nu se vor aplica la ignorarea exonului pentru mutaţiile rare, întrucât nu există un număr suficient de pacienţi pentru a derula studii clinice pe scară largă [59].

O altă problemă este aceea că, datorită ciclului oligonucleotidelor antisens şi a fibrelor musculare, pacienţii necesită tratament repetat. Există gene umane care sunt alcătuite dintr-un ARN şi o parte de proteină şi este posdibil să se înlocuiască această parte regulată de ARN cu o secvenţă antisens de interes. Cele mai des folosite gene pentru această operaţie sunt particulele ribonucleoproteice nucleare mici din clasa U1 şi U7 [60,61]. Întrucât aceste gene sunt foarte mici, ele se încadrează într-un vector AAV. La şoarecii mdx tratamentul cu AAV care conţine gene antisens U1 sau U7 a avut ca rezultat ignorarea exonului 23, refacerea distrofinei şi îmbunătăţirea funcţională [60,61]. Totuşi, această abordare se confruntă cu aceleaşi probleme ca şi furnizarea de microdistrofină prin intermediul AAV.

Tabelul I: Compuşi aflaţi în prezent sau recent în studii clinice pentru DMD

¹ La adresa web www.clinicaltrials.gov, se pot afla mai multe informaţii despre încercările menţionate utilizând acest număr unic de identifi care.

În final, este momentul să lansăm un avertisment. În timp ce rezultatele obţinute până acum prin procedeul de ignorare a exonului sunt încurajatoare, studiile efectuate pentru a valida ipoteza că procedeul de ignorare a exonului 51 funcţionează efectiv (i.e. duce la îmbunătăţirea funcţională) şi este sigur sunt încă în derulare. Astfel, ignorarea exonului este încă o abordare terapeutică potenţială şi nu este deja un tratament, iar până se raportează rezultatele studiilor controlate prin placebo, pacienţii nu ar trebui trataţi cu aceşti compuşi [62].

CONCLUZII

Există mai multe abordări terapeutice diferite care sunt adoptate şi multe dintre ele au ajuns la cea de-a treia fază a studiului clinic. Cu toate acestea nu trebuie să avem aşteptări prea mari, în general mai puţin de 10% dintre compuşii care intră în faza a treia a studiului clinic ajung să devină un medicament înregistrat. Aplicaţia care este cel mai aproape de aplicaţia clinică (ignorarea exonului) este specifică mutaţiei şi se aplică doar unui subset de pacienţi. Mai mult, ea nu îi va vindeca pe pacienţi, ci le va îmbunătăţi fenotipul. În timp ce este de înţeles ca punctul de interes să fie un tratament sau un remediu, nu trebuie să uităm că îmbunătăţirea îngrijirilor are o influenţă uriaşă în supravieţuire (de la sub 20 de ani la peste 30 de ani) şi pentru calitatea vieţii [8,9].

BIBLIOGRAFIE

1. Emery AE: The muscular dystrophies. Lancet 2002, 359: 687-95.
2. Monaco AP, Bertelson CJ, Liechti-Gallati S, Moser H, Kunkel LM: An explanation for the phenotypic differences between patients bearing partial deletions of the DMD lo-cus. Genomics 1988, 2: 90-5.
3. Blake DJ, Weir A, Newey SE, Davies KE: Function and genetics of dystrophin and dystrophin-related proteins in muscle. Physiol Rev 2002, 82: 291-329.
4. Chen YW, Zhao P, Borup R, Hoffman EP: Expression profil-ing in the muscular dystrophies: identification of novel aspects of molecular pathophysiology. J Cell Biol 2000, 151: 1321-36.
5. Deconinck N, Dan B: Pathophysiology of duchenne muscular dystrophy: current hypotheses. Pediatr Neurol 2007, 36: 1-7.
6. Grounds MD: Two-tiered hypotheses for Duchenne muscular dystrophy. Cell Mol Life Sci 2008, 65: 1621-1625.
7. Bushby K, Finkel R, Birnkrant DJ, Case LE, Clemens PR, Cripe L et al.: Diagnosis and management of Duchenne muscular dystrophy, part 1: diagnosis, and pharmacologi-cal and psychosocial management. Lancet Neurol 2010, 9: 77-93.
8. Bushby K, Finkel R, Birnkrant DJ, Case LE, Clemens PR, Cripe L et al.: Diagnosis and management of Duchenne muscular dystrophy, part 2: implementation of multidisci-plinary care. Lancet Neurol 2010, 9: 177-189.
9. Manzur AY, Kuntzer T, Pike M, Swan A: Glucocorticoid corticosteroids for Duchenne muscular dystrophy. Co-chrane Database Syst Rev 2008, CD003725.
10.  Nagy I: Chemistry, toxicology, pharmacology and pharma-cokinetics of idebenone: a review. Arch Gerontol Geriatr 1990, 11: 177-186.
11. Buyse GM, Van der MG, Erb M, D’hooge J, Herijgers P, Verbeken E et al.: Long-term blinded placebo-controlled study of SNT-MC17/idebenone in the dystrophin deficient mdx mouse: cardiac protection and improved exercise performance. Eur Heart J 2009, 30: 116-124.
12. Buyse GM, Goemans N, van den Hauwe M, Thijs D, de Groot IJ, Schara U et al.: Idebenone as a novel, therapeutic approach for Duchenne muscular dystrophy: Results from a 12 month, double-blind, randomized placebo-controlled trial. Neuromuscul Disord 2011, 21: 396-405.
13. Dorchies OM, Wagner S, Vuadens O, Waldhauser K, Buetler TM, Kucera P et al.: Green tea extract and its major polyphenol (-)-epigallocatechin gallate improve muscle function in a mouse model for Duchenne muscular dystrophy. Am J Physiol Cell Physiol 2006, 290: C616-C625.
14. Williams MS: Myostatin mutation associated with gross muscle hypertrophy in a child. N Engl J Med 2004, 351: 1030-1031.
15. Wagner KR, Fleckenstein JL, Amato AA, Barohn RJ, Bushby K, Escolar DM et al.: A phase I/IItrial of MYO-029 in adult subjects with muscular dystrophy. Ann Neurol 2008, 63: 561-571.
16. Cadena SM, Tomkinson KN, Monnell TE, Spaits MS, Kumar R, Underwood KW et al.: Administration of a soluble activin type IIB receptor promotes skeletal muscle growth independent of fiber type. J Appl Physiol 2010, 109: 635-642.
17. van Deutekom JC, van Ommen GJ: Advances in Duch-enne muscular dystrophy gene therapy. Nat Rev Genet 2003, 4: 774-83.
18. England SB, Nicholson LV, Johnson MA, Forrest SM, Love DR, Zubrzycka-Gaarn EE et al.: Very mild muscular dystrophy associated with the deletion of 46% of dystro-phin. Nature 1990, 343: 180-2.
19. Liu M, Yue Y, Harper SQ, Grange RW, Chamberlain JS, Duan D: Adeno-associated virus-mediated microdystrophin expression protects young mdx muscle from contrac-tion-induced injury. Mol Ther 2005, 11: 245-256.
20. Blankinship MJ, Gregorevic P, Allen JM, Harper SQ, Harper H, Halbert CL et al.: Efficient transduction of skel-etal muscle using vectors based on adeno-associated virus serotype 6. Mol Ther 2004, 10: 671-678.
21. Zaiss AK, Muruve DA: Immune responses to adeno-asso-ciated virus vectors. Curr Gene Ther 2005, 5: 323-331.
22. Mendell JR, Campbell K, Rodino-Klapac L, Sahenk Z, Shil-ling C, Lewis S et al.: Dystrophin immunity in Duchenne’s muscular dystrophy. N Engl J Med 2010, 363: 1429-1437.
23. van PM, Aartsma-Rus A: Opportunities and challenges for the development of antisense treatment in neuromuscular disorders. Expert Opin Biol Ther 2011.
24. Peault B, Rudnicki M, Torrente Y, Cossu G, Tremblay JP, Partridge T et al.: Stem and progenitor cells in skeletal muscle development, maintenance, and therapy. Mol Ther 2007, 15: 867-877.
25. Skuk D, Roy B, Goulet M, Chapdelaine P, Bouchard JP, Roy R et al.: Dystrophin expression in myofibers of Duchenne muscular dystrophy patients following intramuscular injec-tions of normal myogenic cells. Mol Ther 2004, 9: 475-82.
26. Skuk D, Tremblay JP: Intramuscular cell transplantation as a potential treatment of myopathies: clinical and preclinical relevant data. Expert Opin Biol Ther 2011, 11: 359-374.
27. Sampaolesi M, Blot S, D’Antona G, Granger N, Tonlorenzi R, Innocenzi A et al.: Mesoangioblast stem cells ameliorate muscle function in dystrophic dogs. Nature 2006, 444: 574-579.
28. Khurana TS, Watkins SC, Chafey P, Chelly J, Tome FM, Fardeau M et al.: Immunolocalization and developmental expression of dystrophin related protein in skeletal muscle. Neuromuscul Disord 1991, 1: 185-94.
29. Khurana TS, Davies KE: Pharmacological strategies for muscular dystrophy. Nat Rev Drug Discov 2003, 2: 379-90.
30. Tinsley JM, Blake DJ, Roche A, Fairbrother U, Riss J, Byth BC et al.: Primary structure of dystrophin-related protein. Nature 1992, 360: 591-3.
31. Mizuno Y, Nonaka I, Hirai S, Ozawa E: Reciprocal expression of dystrophin and utrophin in muscles of Duchenne muscular dystrophy patients, female DMD-carriers and control subjects. J Neurol Sci 1993, 119: 43-52.
32. Deconinck AE, Rafael JA, Skinner JA, Brown SC, Potter AC, Metzinger L et al.: Utrophin-dystrophin-deficient mice as a model for Duchenne muscular dystrophy. Cell 1997, 90: 717-27.
33. Deconinck N, Tinsley J, De BF, Fisher R, Kahn D, Phelps S et al.: Expression of truncated utrophin leads to major functional improvements in dystrophin-deficient muscles of mice. Nat Med 1997, 3: 1216-1221.
34. Gillis JM: Multivariate evaluation of the functional recovery obtained by the overexpression of utrophin in skeletal mus-cles of the mdx mouse. Neuromuscul Disord 2002, 12: 90-4.
35. Tinsley JM, Fairclough RJ, Storer R, Wilkes FJ, Potter AC, Squire SE et al.: Daily Treatment with SMTC1100, a Novel Small Molecule Utrophin Upregulator, Dramatically Reduces the Dystrophic Symptoms in the mdx Mouse. PLoS ONE 2011, 6: e19189.
36. Bowe MA, Mendis DB, Fallon JR: The small leucine-rich repeat proteoglycan biglycan binds to alpha-dystroglycan and is upregulated in dystrophic muscle. J Cell Biol 2000, 148: 801-810.
37. Amenta AR, Yilmaz A, Bogdanovich S, McKechnie BA, Abedi M, Khurana TS et al.: Biglycan recruits utrophin to the sarcolemma and counters dystrophic pathology in mdx mice. Proc Natl Acad Sci U S A 2011, 108: 762-767.
38. Aartsma-Rus A, Fokkema I, Verschuuren J, Ginjaar I, van Deutekom J, van Ommen GJ et al.: Theoretic applicability of antisense-mediated exon skipping for Duchenne muscular dystrophy mutations. Hum Mutat 2009, 30: 293-299.
39. Howard MT, Anderson CB, Fass U, Khatri S, Gesteland RF, Atkins JF et al.: Readthrough of dystrophin stop codon mutations induced by aminoglycosides. Ann Neurol 2004, 55: 422-426.
40. Barton-Davis ER, Cordier L, Shoturma DI, Leland SE, Sweeney HL: Aminoglycoside antibiotics restore dystro-phin function to skeletal muscles of mdx mice. J Clin Invest 1999, 104: 375-81.
41. Barton ER: Constituents of gentamicin promote nonsense suppression and restoration of dystrophin function in mdx mice. 6-10 September; Montpellier (France); 2003.
42. Malik V, Rodino-Klapac LR, Viollet L, Wall C, King W, Al-Dahhak R et al.: Gentamicin-induced readthrough of stop codons in duchenne muscular dystrophy. Ann Neurol 2010, 67: 771-780.
43. Hirawat S, Welch EM, Elfring GL, Northcutt VJ, Paushkin S, Hwang S et al.: Safety, tolerability, and pharmacokinetics of PTC124, a nonaminoglycoside nonsense mutation sup-pressor, following single- and multiple-dose administration to healthy male and female adult volunteers. J Clin Phar-macol 2007, 47: 430-444.
44. Welch EM, Barton ER, Zhuo J, Tomizawa Y, Friesen WJ, Trifillis P et al.: PTC124 targets genetic disorders caused by nonsense mutations. Nature 2007, 447: 87-91.
45. Finkel RS: Read-through strategies for suppression of nonsense mutations in Duchenne/ Becker muscular dystrophy: aminoglycosides and ataluren (PTC124). J Child Neurol 2010, 25: 1158-1164.
46. Aartsma-Rus A: Antisense-mediated modulation of splic-ing: Therapeutic implications for duchenne muscular dys-trophy. RNA Biol 2010, 7.
47. Aartsma-Rus A, van Ommen GJ: Less is more: therapeutic exon skipping for Duchenne muscular dystrophy. Lancet Neurol 2009, 8: 873-875.
48. Kinali M, rechavala-Gomeza V, Feng L, Cirak S, Hunt D, Adkin C et al.: Local restoration of dystrophin expression with the morpholino oligomer AVI-4658 in Duchenne muscular dystrophy: a single-blind, placebo-controlled, dose-escalation, proof-of-concept study. Lancet Neurol 2009, 8: 918-928.
49. van Deutekom JC, Janson AA, Ginjaar IB, Frankhui-zen WS, Aartsma-Rus A, Bremmer-Bout M et al.: Local dystrophin restoration with antisense oligonucleotide PRO051. N Engl J Med 2007, 357: 2677-2686.
50. Heemskerk HA, De Winter CL, de Kimpe SJ, Kuik-Ro-meijn P, Heuvelmans N, Platenburg GJ et al.: In vivo com-parison of 2′-O-methyl phosphorothioate and morpholino antisense oligonucleotides for Duchenne muscular dystrophy exon skipping. J Gene Med 2009, 11: 257-266.
51. Heemskerk H, de Winter C., van Kuik P, Heuvelmans N, Sabatelli P, Rimessi P et al.: Preclinical PK and PD Studies on 2′-O-Methyl-phosphorothioate RNA Antisense Oligonucleotides in the mdx Mouse Model. Mol Ther 2010.
52. 53. Goemans NM, Tulinius M, van den Akker JT, Burm BE, Ekhart PF, Heuvelmans N et al.: Systemic Administration of PRO051 in Duchenne’s Muscular Dystrophy. N Engl J Med 2011.
53. Wu B, Moulton HM, Iversen PL, Jiang J, Li J, Li J et al.: Effective rescue of dystrophin improves cardiac function in dystrophin-deficient mice by a modified morpholino oligomer. Proc Natl Acad Sci U S A 2008, 105: 14814-14819.
54. Yin H, Moulton HM, Seow Y, Boyd C, Boutilier J, Iver-son P et al.: Cell-penetrating peptide-conjugated antisense oligonucleotides restore systemic muscle and cardiac dys-trophin expression and function. Hum Mol Genet 2008, 17: 3909-3918.
55. Goyenvalle A, Babbs A, Powell D, Kole R, Fletcher S, Wilton SD et al.: Prevention of dystrophic pathology in severely affected dystrophin/utrophin-deficient mice by morpholino-oligomer-mediated exon-skipping. Mol Ther 2010, 18: 198-205.
56. Moulton HM, Moulton JD: Morpholinos and their peptide conjugates: Therapeutic promise and challenge for Duch-enne muscular dystrophy. Biochim Biophys Acta 2010.
57. Muntoni F: The development of antisense oligonucleotide therapies for Duchenne muscular dystrophy: report on a TREAT-NMD workshop hosted by the European Medi-cines Agency (EMA), on September 25th 2009. Neuromuscul Disord 2010, 20: 355-362.
58. van Ommen GJ, van Deutekom J, Aartsma-Rus A: The therapeutic potential of antisense-mediated exon skipping. Curr Opin Mol Ther 2008, 10: 140-149.
59. Denti MA, Rosa A, D’Antona G, Sthandier O, De Angelis FG, Nicoletti C et al.: Body-wide gene therapy of Duch-enne muscular dystrophy in the mdx mouse model. Proc Natl Acad Sci U S A 2006, 103: 3758-3763.
60. Goyenvalle A, Vulin A, Fougerousse F, Leturcq F, Kaplan JC, Garcia L et al.: Rescue of dystrophic muscle through U7 snRNA-mediated exon skipping. Science 2004, 306: 1796-1799.
61. Aartsma-Rus A: The risks of therapeutic misconception and individual patient (n=1) “trials” in rare diseases such as Duchenne dystrophy. Neuromuscul Disord 2011, 21: 13-15.