ENOLAZA SPECIFICĂ NEURONALĂ CA MARKER DE INJURIE CEREBRALĂ ȘI PARTICULARITĂȚILE ADMINISTRĂRII TRATAMENTULUI NEUROPROTECTIV ÎN EPILEPSIILE COPIILOR DE VÂRSTĂ MICĂ

În cadrul multor afecțiuni acute și cronice neurologice, inclusiv epilepsia, care evoluează cu neurodistrucție focală sau difuză are loc eliberarea de proteine, enzime, fermenți neurospecifici din celulele afectate ale creierului în spațiul interstițial și ulterior, în lichidele biologice ale organismului. Una din direcțiile actuale de imunodiagnosticare este studierea concentrației serice de proteine neurospecifice, pentru rezolvarea problemelor de diagnostic, monitorizare și prognozare a evoluției procesului patologic. Unul dintre acești markeri este enolaza specifică neuronală (NES). Aceasta din urmă este eliberată atunci cînd țesutul nervos este traumatizat. Se utilizează pentru diagnosticul stărilor caracterizate prin ischemie și hipoxie cerebrală, precum și studiere a patogeniei afecțiunilor neurologice, care decurg cu afectarea barierei hematoencefalice. În ultimii ani a fost depistată creșterea concentrației de NSE în țesutul nervos și în lichidele biologice ale bolnavilor de epilepsie, precum și pe modele animale, la care s-au dezvoltat convulsii.(7,8).

SCOPUL STUDIULUI

Evidențierea corelației dintre epilepsia copilului (tipul accesului convulsiv, frecvența acestuia, vârsta de debut a epilepsiei, prezența retardului neuropsihic) și nivelul seric al enolazei specifice neuronale, precum și particularitățile administrării tratamentului antiepileptic în combinație cu cel neuroprotector în epilepsiile nou-născuților și sugarilor.

MATERIAL ȘI METODE

Studiul a fost efectuat la baza clinică ICȘ DOSM și C (Institutul de Cercetări Științifice în Domeniul Ocrotirii Mamei și Copilului) din Orașul Chișinău, în secțiile de neuropsihiatrie a nou-născuților și psihoneurologie și epileptologie pe parcursul anilor 2007-2009. Pentru realizarea obiectivelor propuse, în studiu au fost incluși 108 copii (lotul I), cu vârstele cuprinse între 2 săptămâni -24 luni (vârsta medie
9,2±1,2 luni), dintre aceștea 61 (56,0%) – băieței și 47 (44,0%) fetițe. Grupul de referință a fost constituit din 108 copii fără istoric de accese convulsive, practic sănătoși (lotul II) de aceiași vârstă, dintre care 49 băieței (45,0%) și 59 (55,0%) fetițe.

Selectarea pacienților pentru lotul de cercetare
s-a efectuat după următoarele criterii de includere: (1) convulsii epileptice de orice tip sau etiologie, (2)
schimbări specifice la EEG (dar nu obligatoriu), (3) vîrsta (2 săptămâni-24 luni). Copiii care au manifestat convulsii acute, dar care la momentul examinării pe EEG încă nu se formase focarul epileptic deasemenea au fost înrolați în studiu. Pentru evaluarea pacienților a fost alcătuit un chestionar special, în care au fost incluse datele necesare pentru colectarea notificărilor demografice, de cercetare clinică și paraclinică: numele prenumele, datele anamnezei perinatale, prezența de convulsii de diferite etiologii, vârsta de debut a convulsiilor, tipul convulsiilor, frecvența și durata lor, factorul declanșator posibil, lungimea perioadei intercritice, prezența de convulsii la rude, devieri în statusul neurologic la momentul examinării, preparate antiepileptice utilizate, schimbări în valorile marcherilor biologici studiați, eficacitatea tratamentului combinat administrat. Tipul epilepsiei a fost stabilit pe baza Clasificării internaționale a epilepsiilor, sindroamelor epileptice și a afecțiunilor paroxismale înrudite (2000) (Liga Internațională de Combatere a Epilepsiei): (1) epilepsie idiopatică, (2) epilepsie simtomatică, (3) epilepsie criptogenă.

Accesele convulsive au fost clasificate în conformitate Clasificarea internațională a crizelor epileptice (1981) (Liga Internațională de Combatere a Epilepsiei): (a) parțiale (simple, complexe), (b) generalizate (absențe, tonice, clonice, tonico-clonice, mioclonice, atonice).Pentru nou-născuții incluși în studiul nostru (11 cazuri), cu vârstele cuprinse între 2 și 4 săptămîni, stabilirea diagnosticul de epilepsie s-a bazat pe datele anamnestice (convulsii în maternitate, relatate de neonatologi sau serviciul de reanimare neonatologică), din observațiile proprii ale mamei și ale medicului neuropediatru, precum și din datele examinării prin EEG (criteriu neobligatoriu).

Tabelul 1. Caracteristica generală a lotului de cercetare (n=108) și a lotului de referință (n=108)

Fig1. Strucura după sex a persoanelor incluse în studiu

Din datele expuse în tabelul de mai sus se vede că loturile de copii sunt omogene după vârstă și sexul pacienților (>0,05).

Pentru evaluarea nivelului seric al enolazei specifice neuronale de la copiii din lotul de studiu și cel de control a fost recoltat 3 ml de sânge venos, care a fost centrifugat și congelat la temperatura de -20º C. Ne-am străduit ca diferența de timp dintre ultima convulsie și venepuncție să fie cât mai mică, sau chiar să urmeze direct ultimul acces. Ulterior serul a fost transportat la sediul firmei “DAC-Spectro Med”, unde au fost efectuate examinările respective. Ulterior, după administrarea tratamentului, peste 3 luni, la copiii incluși în lotul I de studiu a mai fost prelevat sânge, pentru examinarea marcherilor biologici sus numiți și evaluarea modificării concentrațiilor serice ale acestora după aministrarea tratamentului neuroprotectiv. Pentru determinarea enolazei specif ice neuronale s-a utilizat testul NSE ELISA (EIA-4610). Metoda se prezintă ca o metodă imunoenzimatică calorimetrică în determinarea cantitativă a concentrației enolazei specifice în ser (2-fosfo-D-glicerat hidrolaza),care este o izoenzimă ce face parte din familia enolazelor.Testul se bazează pe conjugarea enolazei neuronale specifice cu doi anticorpi monoclonali, unul imobilizat fiind pe microplanșete, altul fiind conjugat cu peroxidaza ce se utilizează pentru această procedură. Intensitatea colorării a fost direct proporțională cu concentrația enolazei. Valorile normale ale acesteia sunt 0-12 ng-ml, iar cele patologice sunt cele mai mari de 12 ng-ml.

Ulterior pacienții din lotul I au fost divizați prin metodă aleatorie în trei subloturi a câte 36 de pacienți. Copiii din sublotul I au primit tratament antiepileptic combinat cu Caraxon, cei din sublotul II li s-a asociat wla tratamentul de bază Cortexin, iar pacienții din sublotul III au primit numai tratament antiepileptic. Tratamentul de bază a constat în administrarea preparatelor antiepileptice, care au fost diferențiate în funcție de tipul crizei. Cel mai des pentru convulsiile generalizate s-a utilizat acidul valproic (Orfiril , Depakine), iar în accesele parțiale s-a utilizat carbamazepina (Timonil, Finlepsin). Cel mai des s-au utilizat siropurile, care sunt mai ușor de administrat la copii. Preparatul Ceraxon dispune de o formă de administrare sub formă de sirop. El a fost administrat în doză de 1 ml (100 mg) de 2-3 ori în 24 de ore în funcție de vârsta copilului timp de 3 luni.

Preparatul medicamentos Cortexin a fost administrat în doza de 0,5 mg la kg, i/m , timp de 10 zile.

Ulterior am repetat această cură de tratament peste 2 luni. Astfel, copiii din lotul I de studiu au primit două cure de tratament cu Cortexin a câte 10 zile fiecare. Ulterior peste 3 luni de la inițierea tratamentului combinat aceștea au fost evaluați repetat fie în condiții de ambulator, fie în staționar.
Copiii din sublotul III au primit doar remediile antiepileptice corespunzătoare tipului de crize.

Aceștia la fel au fost evaluați după trei luni de tratament.

REZULTATELE OBȚINUTE

Analizând nivelul concentrației serice a NSE în cele 3 grupe de epilepsii în care au fost divizați copiii, s-au obținut următoarele date (Tabelul 2.)

Tabelul 2. Prevalența NSE în grupul copiilor cu accese generalizate, focale și cu accese polimorfe

Tabelul 3. Corelația dintre valorile NSE și frecvența acceselor convulsive</p >

Corelația între frecvența acceselor convulsive și prezența crescută a enolazei specifice neuronale este prezentată în tabelul de mai sus (Tabelul 3.).Putem remarca faptul că frecvența titrului majorat al enolazei specifice neuronale este în corcondanță directă cu frecvența acceselor convulsive. Pentru accesele cu frecvență înaltă (de câteva ori pe zi) nivelul enolazei specifice neuronale a fost majorat în 50% din numărul total de cazuri. De asemenea, cu cât frecvența este mai mică, cu atât și numărul de cazuri depistate este mai mic.
Corelația dintre vârsta de debut a convulsiilor și titrul de NSE crescut este expusă în tabelul de mai jos. (Tab.4)

Tabelul 4. Corelația dintre vârsta de debut a acceselor epileptice și titrul de NSE

Un aspect important la care ne referim este relația dintre prezența retardului asociat epilepsiei și nivelul de NSE. În tabelul de mai jos este expusă această corelație.(Tab.5)

Tabelul 5. Corelația dintre retardul asociat epilepsiei și nivelul NSE din ser

Aprecierea tratamentului după criteriul evaluării concentrației enolazei specif ice neuronale.

Tabelul 6. Nivelurile concentrației serice a enolazei specif ice neuronale în grupurile de studiu înainte și după tratament

Astfel, valoarea medie a concentrației serice a enolazei în primul grup de studiu până la tratament a constituit 20,818·0,920, iar după tratament 10,108·1,322 (t=6,652,p<0,001). Se evedențiază o diferență statistică comparativă dintre variațiile concentrației enolazei până la tratamentul cu Ceraxon și după acesta, astfel acest preparat prezintă un factor de neuroprotecție în cazul convulsiilor destul de semnificativ. În cel de-al II-lea grup de studiu deasemenea avem o diferență destul de semnificativă între variațiile concentrației până și după tratament. Astfel, valoarea medie a enolazei până la administrarea Cortexinului a constituit 21,183 · 1,407, iar după 9,952 · 0,955 (t=6,606,p<0,001). De aici putem vedea indirect efectul pozitiv al Cortexinei ca agent neuroprotector.

Deasemenea am analizat omogenitatea acestor grupe de studiu, evaluând și comparând valorile medii ale enolazei între I și III grupă, II și III grupă, I și II grupă până la tratament. Pentru grupele I și III t=0,344,>0,05, pentru II și III grupă t=0,081,>0,05, iar pentru cea de-a I și II grupă t=0,217,>0,05. Deci diferență statistică între concentrațiile enolazei între aceste trei grupe până la tratament nu se evidențiază.

După administrarea tratamentului am obținut o diferență statistică între I și III grupă de studiu (t=2,283,p<0,05),între II și III grupă (t=3,802,p<0,05), iar între I și II grupă (t=0,096,>0,05) nu a fost remarcată o semnificație statistică, ceea ce ne face să credem că ambele preparate sunt benefice și au practic aceleași proprietăți neuroprotective în cadrul copiilor din grupul de studiu.

CONCLUZII

1. Frecvența titrului crescut al enolazei specifice neuronale este în concordanță directă cu frecvența acceselor convulsive. Pentru accesele cu frecvență înaltă (de câteva ori pe zi) nivelul enolazei specifice neuronale a fost majorat în 50% din numărul total de cazuri.
2. Există o corelație puternică între prezența retardului neuropsihic și motor și nivelul ridicat al enolazei specifice neuronale.
3. Deasemenea este remarcată o corelație medie între grupul de copii cu vârsta mai mică de 1 lună și nivelul enolazei. Acest lucru este posibil legat cu evenimentele hipoxic -ischemice care au loc imediat după naștere la unii copii.
4. Este remarcată o diferență statistică comparativă dintre variațiile concentrației enolazei până și după tratamentul cu Ceraxon și Cortexin, astfel putem concluziona că aceste preparate prezintă un factor de neuroprotecție în cadrul convulsiilor epileptice la copii.

BIBLIOGRAFIE

1. Ben-Ari Y. 1985; Limbic seizure and brain damage produced by kainic acid. Mechanisms and relevance to human temporal lobe epilepsy. Neuroscience 14:375403.
2. Holmes G. 1991; Do seizures cause brain damage? Epilepsia 32(supplS):S 14-28.
3. Marksteiner J, Prommegger R, Sperk G. 1990; Effect of anticonvulsant treatment on kainic acid-induced increases in peptide levels. Eur J Pharmacol 181:241-6.
4. DeGiorgio CM,Tomiyasu U, Gott PS,Treiman D. 1992; Hippocampal pyramidal cell loss in human status epilepticus. Epilepsia 33:23-7.
5. Cavazos JE, Das I, Sutula TP. 1994; Neuronal loss induced in limbic pathways by kindling: evidence for induction of hippocampal sclerosis by repeated brief seizures. J Neurosci 14:3106-21.
6. Puleo PR, Meyer D,Wathen C, et al. 1994; Use of a rapid assay of subforms of creatine kinase MB to diagnose or rule out acute myocardial infarction. N Engl J Med 331:5614.
7. Marangos P, Schmechel D, Parma A, Clark R, Goodwin F. Measurement of neuron specific enolase (NSE) and nonneuronal (NNE) isoenzymes of enolase in rat, monkey and human nervous system. J Neurochem 1979;33:319-29.
8. Shimizu A, Suzuki F, Kato K. 1983; Characterization of alpha, beta and gamma human enolase isoenzymes and preparation of hybrid enolases from homodimeric forms. Biochem Biophys Acta 748:278.
9. Zomzely-Neurath CE. 1982; Nervous system specific proteins: 14-3-2 protein, antigen alpha and neuron specific enolase. Scand J Zmmunol 15(suppl9): 140.
10. Lafon-Cazal M, Bougault I, Steinberg R, Pin J, Bockaert J. 1992; Measurement of gamma enolase release, immune method for selective quantification of neurotoxicity independently from glial lysis. Brain Res 593:63-8.
11. Royds JA, Timperley WR, Taylor CB. 1988; Levels of enolase and other enzymes in the cerebrospinal fluid as indices of pathologic change. J Neurol Neurosurg Psychiatry 19:
12. DeGiorgio CM, Correale JD, Gott PS, et al. 1995; Serum neuron specific enolase (s-NSE) in human status epilepticus. Neurology 45: 1134-7.
13. Royds JA, Aelwyn G, Davies-Jones B, Lewtas NA, Timperley WR, Taylor CB. 1983; Enolase isoenzymes in the cerebrospinal fluid of patients with diseases of the nervous system. J Neurol Neurosurg Psychiatry 46: 1031-6.