Particularități clinico-genetice în infertilitatea masculină

REZUMAT
Introducere: Infertilitatea masculină prezintă o etiologie heterogenă, cel mai frecvent fi ind cauzată de tulburările de spermatogeneză, clinic manifestată prin oligo-azoospemie. În aproximativ 30% dintre cazurile de infertilitate masculină asociate cu oligo-azoospemie poate fi depistată o cauză genetică. Scopul: Determinarea variațiilor cromozomiale, microdelețiilor cromozomului Y în regiunea AZF (Azoospermia Factor) și a mutațiilor la nivelul genei CFTR (Cystic fi brosis transmembrane conductance regulator) la bărbații infertili, înainte de tehnicile de reproducere asistată (ART).
Materiale si metode: Un grup de 45 de bărbați infertili au fost cercetați în timpul consilierii genetice din cuplurile infertile menționate pentru tratamentul ART. Criteriile pentru includerea pacienților fi ind prezența azoospermiei, niveluri ridicate sau normale de FSH, LH și testosteron. A fost efectuat examenul citogenetic prin tehnica clasică de marcaj G, la toți pacienții azoospermici. ADN-ul genomic a fost izolat și utilizat pentru analiza microdeleților din regiunea AZF și mutațiilor în gena CFTR prin tehnica PCR. Au fost analizate prin multiplex PCR regiunele AZFa (SY86, SY84), AZFb (SY127, SY134) și AZFc (SY254, SY255). Pentru gena CFTR au fost testate două mutații comune ΔF508 și G542X.
Rezultate: Din 45 de cazuri de bărbați infertili cu azoospermie, 34 au prezentat cariotip normal (46,XY). În 11 cazuri s-au găsit anomalii cromozomiale, inclusiv 7 pacienți cu sindromul Klinefelter (47,XXY), 1 pacient cu cariotip 46,XX, 1 pacient cu translocație autozomală echilibrată 46,XY,der(5), t(9;5) și 2 pacienți cu polimorfi sme cromozomiale 46,XYqh+, 46,XY,14ps+. La 2 pacienți cu cariotip normal au fost diagnosticați cu deleții în regiunea AZFc, ce cuprinde următorii markeri SY254 și SY255. La pacientul cu XX la bărbați, au fost depistate deleții în fi ecare regiune din AZFa-sY84, sY86; AZFbsY124, sY134; AZFc-sY254, sY255 și prezența genei SRY și ZFY. La 2 bărbați au fost diagnosticați ca purtători ai mutații în gena CFTR – ΔF508; pentru calcularea riscului de recurență la descendenți au fost, de asemenea, investigate soțiile lor, care au fost homozigote. Concluzie: Studiul actual evidențiază pentru toate cuplurile cu diagnosticul de infertilitate masculină cu azoospermie necesitatea testelor genetice și a consilierii înainte de folosirea tehnicilor de reproducere asistată. Acest lucru este important pentru diagnosticul corect cât și tratamentul cuplurilor cu infertilitate.
Cuvinte cheie: masculin, infertilitate, cariotip, microdeleție, regiune AZF, azoospermie

INTRODUCERE Infertilitatea este o problemă la nivel mondial ce afectează 15% din cuplurile de vârstă reproductivă care au avut contact sexual neprotejat. În jumătate din aceste cazuri, un factor cauzal masculin poate fi responsabil de infertilitate [1,2]. O mare parte dintre acești pacienți, aproximativ 15%, sunt diagnosticați ca azoospermici, iar factorii genetici explică 21-29% dintre aceste cazuri [3,4]. Anomaliile cromozomiale sunt una dintre cauzele principale ale azoospermiei, fiind prezente la aproximativ 15% dintre bărbații azoospermici, aceste rate fiind mult mai mari decât frecvența în populația generală care este de aproximativ 0,6%. Cea mai frecventă anomalie cromozomială la bărbații cu azoospermie este sindromul Klinefelter cu o prevalență de 10% [5]. Mai multe mii de gene sunt implicate în dezvoltarea sexuală normală, determinarea testiculelor și spermatogeneză. Astăzi, doar câteva au o importanță clinică de rutină, dar numărul lor este în creștere odată cu noua generație de secvențiere. Există un interes special pentru genele brațului lung al cromozomului Y, deoarece acestea joacă un rol esențial în spermatogeneză și dezvoltarea testiculelor. Cele mai multe dintre aceste gene sunt situate într-o regiune specifică cunoscută ca regiunea Azoospermia factor (AZF). Există trei domenii genetice în AZF (AZFa, AZFb, AZFc) pe cromozomul Y și microdelețiile genelor din aceste regiuni s-au dovedit a fi asociate cu azoospermie sau oligozoospermie severă [6]. Microdelețiile cromozomului Y sunt cea mai frecventă cauză moleculară-genetică a infertilității masculine. Frecvența microdeleților cromozomiale Y în azoospermia nonobstructivă este de aproximativ 10%, iar oligozoospermia severă este de 5% [7]. La bărbații cu azoospermie obstructivă este de asemenea dovedită importanța practică a genei CFTR (Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator). Mutațiile acestei gene determină fibroză chistică și absența vaselor deferente. Bărbații cu azoospermie cauzate de unele dintre aceste anomalii genetice pot beneficia de tehnici de recuperare a spermei și pot concepe proprii copiii biologici. Utilizarea tehnologiilor de reproducere asistată, cum ar fi injecția intracitoplasmică de spermatozoizi (ICSI) și extragerea spermei testiculare (TESE), poate ocoli selecția naturală și transmiterea anomaliilor genetice la descendenți [8].

SCOPUL
Determinarea variațiilor cromozomiale, microde lețiilor cromozomului Y în regiunea AZF (Azoospermia Factor) și a mutațiilor la nivelul genei CFTR (Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) la bărbații infertili, înainte de tehnicile de reproducere asistată (ART).

MATERIALE ȘI METODE
În acest studiu au fost investigați 45 de bărbați infertili în timpul consilierii genetice dintre cuplurile infertile menționate pentru tratamentul ART, înainte de injectarea intracitoplasmică a spermei (ICSI). Toți pacienții au semnat un consimțământ informat, aprobat de comitetul local de etică, iar studiul a fost efectuat în conformitate cu declarația de la Helsinki II. Conform analizei spermogramei, bărbații au fost azoospermici. Analiza materialului seminal s-a efectuat după o perioadă de abstinență sexuală de 2-7 zile, în conformitate cu recomandările Organizației Mondiale a Sănătății (OMS, 2010). Criteriile pentru includerea pacienților în studiu au fost îndeplinite dacă au prezentat azoospermie, niveluri crescute sau normale de hormon foliculostimulant (FSH), hormon luteinizant (LH) și testosteron. Analiza cariotipului a fost efectuată pe culturi de limfocite din sângele periferic utilizând metoda citogenetică clasică de bandare G. După 72 de ore de cultivare, celulele au fost recoltate, hipotonizate și fixate utilizând metanol. Au fost analizate cel puțin 10 metafaze per caz, iar în cazurile de suspiciune de anomalii numărul metafazelor a fost mărit. Anomaliile cromozomiale au fost raportate conform recomandărilor ISCN (International System of Cytogenetic Nomenclature) 2016. ADN-ul genomic a fost izolat conform procedurii standard din sânge periferic și utilizat pentru a analiza microdelețiile din regiunea AZF și mutațiile la nivelul genei CFTR prin tehnica PCR (Reacția de polimerizare în lanț). Secvențele țintă utilizate au fost sY84 și sY86 (AZFa), sY127 și sY134 (AZFb), sY254 și sY255 (AZFc) și SRY și ZFX/ZFY (pentru control). Amorsele specifice utilizate pentru amestecul multiplex și lungimile produselor PCR sunt prezentate în Tabelul I. Două mutații frecvente ale genei CFTR au fost testate ΔF508 și G542X

REZULTATE
Din 45 de cazuri de bărbați infertili cu azoospermie, 34 au avut cariotip normal (46, XY). În 11 cazuri s-au depistat anomalii cromozomiale, incluzând 9 cazuri ale cromozomilor sexuali și 2 cazuri de anomalii cromozomiale autozomale. Cea mai frecventă anomalie a cromozomilor sexuali a fost sindromul Klinefelter în 7 cazuri (figura 1, tabelul II) cu forma clasică 47,XXY. De asemenea, am detectat un caz rar de inversie sexuală la bărbatul cu cariotip 46,XX (figura 5), 1 pacient cu translocație autosomală echilibrată 46,XY,der(5),t(9,5)(9pt::5q23.3→qter) (figura 2) și 2 persoane cu polimorfism cromozomial 46,XYqh + (figura 3), 46,XY,14ps +.

Majoritatea pacienților cu sindromul Klinefelter au fost semnificativ mai înalți decât pacienții cu cariotipuri normale. De asemenea, au prezentat testicule mici, ferme, hipogonadism și ginecomastie. Vârsta medie a pacienților cu sindrom Klinefelter a fost de 33,8, motivul principal al adresării la medic fiind infertilitatea (tabelul II).

Deleții ale cromozomului Y au fost observate în regiunile AZFc la 2 pacienți (figura 4) cu caracteristici ale cariotipului normal, markerii lipsă fiind sY254 și sY255. Ambii au avut o istorie a infertilității mai mult de 5 ani, o ușoară creștere a hormonului foliculostimulant (FSH) și nivelul seric de testosteron a fost redus.

Microdeleții în fiecare regiune din AZFa-sY84, sY86; AZFb-sY124, sY134; AZFc-sY254, sY255
și prezența genei SRY și ZFY au fost detectate la pacientul cu tulburare testiculară XX de dezvoltare sexuală (figura 6). Rezultatele markerilor endocrini ai pacientului a arătat o creștere ușoară a hormonului foliculostimulant (FSH) de 11 mlU/ml (interval normal de 2,0-10,0 mlU/ml), concentrația de testosteron în ser fiind scăzută 1,3 ng/ml (interval normal de 2,0-6,9 ng/ ml), în timp ce Hormonul luteinizant (LH) a fost în limitele normale 5.5 mlU/ ml (intervalul normal este de 2,0-12,0 mlU/ml).
Fenotipul și identitatea psihologică a pacientului de sex masculin, cu o înălțime și greutate în limitele normei, organele genitale caracteristice sexului masculin cu hipogonadism. Conform rezultatului spermogramei a prezentat azoospermie.
Doi bărbați au fost depistați ca purtători ai unei mutații genice CFTR-ΔF508 (figura 7), pentru calcularea riscului de recurență la descendenți au fost, de asemenea, investigate soțiile lor, care au fost homozigote.

DISCUȚII
Frecvența aberațiilor cromozomiale la pacienții studiați este semnificativ mai mare – 24,4% (11/45), decât cea citată în alte surse bibliografice. Rezultatele studiului nostru sunt, desigur, datorate faptului că am investigat bărbații cu azoospermie. Este bine cunoscut faptul că anomaliile cromozomiale cresc odată cu scăderea numărului de spermatozoizi [9]. Anomaliile cromozomiale sexuale au predominat în 9 cazuri; spre deosebire anomaliile cromozomiale autozomale în 2 cazuri. Cea mai frecventă anomalie a cromozomilor sexuali a fost 47,XXY – 15,5% (7/45), (figura 1, tabelul II). Această incidență crescută a sindromului Klinefelter în rândul bărbaților azoospermici este de asemenea raportată în sursele bibliografice [10].
Vârsta medie a pacienților a fost de 33,8 (interval de 24 până la 47 ani), iar durata mediană a infertilității a fost de 7,8 (interval de 5 până la 15 ani) (tabelul II). Aceste cazuri reflectă realitatea, un număr mare de cazuri sunt detectate după pubertate la pacienții cu azoospermie ce consultă clinicile de infertilitate. Marea majoritate, mai mult de 90% din bărbații cu forma clasică 47,XXY, sunt azoospermici și nu ar putea să conceapă un copil în mod natural [7,11]. Cu toate acestea, în prezent, pacienții cu sindromul Klinefelter, inclusiv tipul non-mozaic, nu mai trebuie să fie considerați irevocabil infertili. ICSI oferă posibilitatea reproducerii chiar și atunci când spermatozoizii nu sunt prezenți în ejaculat, dar există riscul să conceapă urmași cu anomalii cromozomiale [12,13]. În studiul prezentat, un pacient a fost diagnosticat cu cariotip XX (figura 5). Sunt descrise în literatura de specialitate, două categorii ale acestui sindrom, SRY pozitivi la 80% dintre pacienți și SRY negativi la 20%.
Cazul prezentat se referă, de asemenea, la categoria SRY pozitivi, gena SRY fiind detectată prin examinarea moleculară multiplex PCR (figura 6). Această afecțiune rară apare la aproximativ 1/20.000 și a fost denumită inițial – sindromul masculin XX, în anul 2005 a fost revizuită nomenclatora actuală de tulburare testiculară de dezvoltare sexuală (DSD). Datele din literatură descriu cazuri sporadice ale acestui sindrom, deși au fost de asemenea raportate cazuri familiale. Acest caz, a fost considerat, de asemenea, sporadic pe baza istoricului familial. Diagnosticul precoce al bărbaților XX este adesea ratat datorită dezvoltării relativ normale a organelor sexuale și a fenotipului. După pubertate majoritatea dintre ei prezintă hipogonadism, azoospermie și infertilitate. Cazul nostru a fost diagnosticat la vârsta de 31 de ani datorită aceleiași cauze menționate anterior azoospermie și infertilitate.
Posibilitățile de fertilitate la pacienții cu 46,XX sunt limitate. Doar următoarele opțiuni pot fi: înseminarea artificială cu spermă de la donator (AID) sau adopție. Translocațiile autozomale echilibrate au fost raportate în sursele bibliografice de specialitate printre bărbații oligozoospermici și azoospermici [15]. În studiul curent s-au observat la un bărbat azoospermic 46,XY,der(5),t(9;5)(9pter::5q23.3→qter) (figura 2), frecvența fiind de 2,2% (1/45 de pacienți). Pacienții care sunt purtători de translocații echilibrate au fenotip normal, dar pot produce gameți anormali, cu potențialul ca acest fenotip anormal să fie moștenit de către un copil conceput prin ICSI [16]. Infertilitatea masculină este asociată în tot mai multe studii în ultimii ani cu polimorfismele cromozomiale. În studiul nostru au fost prezente la doi participanți 46,XYqh + (figura 3), 46,XY, 14ps+. Rolul polimorfismelor cromozomiale în infertilitate a fost studiat anterior de către mulți autori și, în ciuda faptului că numărul lor a fost ridicat în cuplurile infertile, acest subiect continuă să fie o întrebare intrigantă, fără a avea o relevanță clinică pe deplin elucidată [17]. În studiul actual, microdelecțiile din regiunea AZF au fost detectate în 2 cazuri (4,4%) din cele 45 de bărbați azoospermici. Ambii pacienți au prezentat lipsa sY254 și sY255, care corespunde cu gena DAZ din regiunea AZFc (Figura 4). La nici un pacient nu au fost detectate deleții AZFa și AZFb. Ambele cazuri cu ștergeri au avut cariotip normal (46, XY). Familia genei DAZ (Deleted in Azoospermia) este raportată ca fiind cea mai frecventă genă ce prezintă deleții în regiunea AZF cu o frecvență de 13% la bărbații azoospermici, în concordanță bună cu rata microdelețiilor de la 5% la 20% [18, 19, 20, 21]. Gena DAZ aparține unei familii de gene, care codifică proteinele ce se leagă la ARN fiind exprimate exclusiv în celulele germinale și controlează spermatogeneza. Delețiile locusului AZFc cauzează defecte ale spermatogenezei variind în severitate, de la azoospermie datorată celulelor Sertoli până la oligospermie [22]. Fibroza chistică (CF) este o afecțiune autosomal recesivă detrminată de mutații în gena CFTR. În studiul de față s-au găsit doi bărbați ca purtători ai mutații genice CFTR- ΔF508 (figura 7). Mutația ΔF508 este cea mai frecventă mutație a genei CFTR cu frecvență în aproximativ 50-80% [23]. Pentru bărbații cu mutații CFTR, testarea partenerului feminin și consilierea genetică sunt importante înainte de ART. Astfel pentru calcularea riscului de recurență la descendenți au fost, de asemenea, investigate soțiile lor, care au fost homozigote.
CONCLUZII
Studiul realizat evidențiază pentru toate cuplurile cu diagnosticul de infertilitate masculină cu azoospermie necesitatea testelor genetice și a consilierii înainte de folosirea tehnicilor de reproducere asistată. Acest lucru prezintă importanță pentru diagnosticul corect cât și tratamentul cuplurilor cu infertilitate.

BIBLIOGRAPHY
1. O’Flynn O’Brien KL, Varghese AC, Agarwal A. Th e genetic causes of male factor infertility: a review. Fertil Steril. 2010 Jan;93(1):1-12
2. Agarwal A, Mulgund A, Hamada A, Chyatte MR. A unique view on male infertility around the globe. Reprod Biol Endocrinol. 2015 Apr 26;13:37.
3. Dohle GR, Halley DJ, Van Hemel JO, van den Ouwel AM, Pieters MH, Weber RF, et al. Genetic risk factors in infertile men with severe oligozoospermia and azoospermia. Hum Reprod. (Oxford, England) 2002;17:13-16. 4. Lee JY, Dada R, Sabanegh E, Carpi A, Agarwal A. Role of genetics in azoospermia. Urology. 77(3):598-601.
5. Özlem Okutman. Genetics of male infertility: genes implicated in non-obstructive azoospermia and severe oligozoospermia. Reproductive Biology. Université de Strasbourg, 2015. English. ff NNT: 2015STRAJ049ff .
6. Jadranka Sertiæ, Petar Cvitkoviæ, Angela Myers, Randall K. Saiki, Ana Stavljeniæ Rukavina. Genetic Markers of Male Infertility: Y Chromosome Microdeletions and Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Gene Mutations. Croatian Medical Journal. 2001; 42(4):416-420.
7. Ferlin A, Arredi B, Foresta C. Genetic causes of male infertility. Reprod Toxicol. 2006; 22:133-41.
8. Georgiou I, Syrrou M, Pardalidis N, et al. Genetic and epigenetic risks of intracytoplasmic sperm injection method. Asian J Androl. 2006;8:643-73.
9. Gary L Harton and Helen G Tempest. Chromosomal disorders and male infertility. Asian Journal of Andrology (2012) 14, 32–39
10. M. Akgul & F. Ozkinay & D. Ercal & O. Cogulu & O. Dogan & B. Altay & E. Tavmergen & C. Gunduz & C. Ozkinay, Cytogenetic abnormalities in 179 cases with male infertility in Western Region of Turkey: Report and review, J Assist Reprod Genet (2009) 26:119–122
11. C.M. Smyth, W.J. Bremner, Klinefelter syndrome, Arch. Intern. Med. 158 (12) (1998) 1309–1314.
12. Fabio Lanfranco, Axel Kamischke, Michael Zitzmann, Eberhard Nieschlag, Klinefelter’s syndrome, Th e Lancet Volume 364, Issue 9430, 2004,17–23 July,273-283
13. Ron-El R, Strassburger D, Gelman-Kohan S, Friedler S, Raziel A, Appelman Z. A 47, XXY fetus conceived after ICSI of spermatozoa from a patient with non-mosaic Klinefelter’s syndrome: case report. Hum Reprod 2000;15:1804–6.
14. I.A. Hughes, C. Houk, S.F. Ahmed, P.A. Lee, Lawson Wilkins Pediatric Endocrine Society/European Society for Paediatric Endocrinology Consensus Group, Consensus statement on management of intersex disorders, J. Pediatr. Urol. 2 (3) (2006) 148–162.
15. M. Balkan, S. Tekes, A. Gedik , Cytogenetic and Y chromosome microdeletion screening studies in infertile males with Oligozoospermia and Azoospermia in Southeast Turkey, J Assist Reprod Genet (2008) 25:559–565.
16. Johnson MD. Genetic risks of intracytoplasmic sperm injection in the treatment of male infertility: recommendations for genetic counseling and screening. Fertil Steril 1998;70: 397-411
17. Denise Maria Christofolini1, Fernanda Abani Mafra, Rubens Pedrenho Neto, Raphael Augusto Saab de Almeida Barros, Aline Amaro dos Santos, Carla Peluso, Marcello Machado Gava, Milton Ghirelli-Filho, Bianca Bianco and Caio Parente Barbosa, Correlation between Chromosomal Variants and Male Infertility in a Population of Brazilian Infertile Men, Reproductive System and Sexual Disorders: 2012, 1:1
18. Briton-Jones C, Haines CJ. Microdeletions on the long arm of the Y chromosome and their association with male-factor infertility. Hong Kong Med J. 2000;6:184–9.
19. Ferlin A, Moro E, Garolla A, Foresta C. Human male infertility and Y chromosome deletions: role of AZF-candidate genes DAZ, RBM and DFFRY. Hum Reprod. 1999;14:1710–6. doi:10.1093/ humrep/14.7.1710
20. Reijo R, Lee TY, Salo P, et al. Diverse spermatogenic defects in humans caused by Y-chromosome deletions encompassing a novel RNA-binding protein gene. Nat Genet 1995;10: 383-93.
21. Vogt PH, Edelmann A, Hirschmann P, K~hler MR. Th e azoospermia factor (AZF) of the human Y chromosome in Yql 1: function and analysis in spermatogenesis. Reprod Fertil Dev 1995;7:685-93.
22. J. A. Loginova, I. I. Nagornaya , S. A. Shlikova, L. I. Petrova, M. V. Ribakova, T. V. Kuznetsova and V. S. Baranov, Molecular Genetic Analysis of Y-Chromosome Microdeletions in Men with Severe Spermatogenetic Defects, Molecular Biology, Vol. 37, No. 1, 2003, pp. 67–73.
23. Grangeia A, Niel F, Carvalho F, Fernandes S, Ardalan A, Girodon E, et al. Characterization of cystic fi brosis conductance transmembrane regulator gene mutations and IVS8 poly(T) variants in Portuguese patients with congenital absence of the vas deferens.19. Hum Reprod. (Oxford, England) 2004;19:2502-2508